Secció de Ciències de la Vida

17/01/2024 | SCIC
Compartir

Compartir

Facebook
X
Linkedin
Whatsapp
Gmail
Imprimir

Unitat de Ciències de la Vida

Tècniques

Citometria de flux

La citometria de flux es basa a mesurar i analitzar simultàniament múltiples característiques de partícules individuals en suspensió, normalment cèl·lules, mentre aquestes circulen embolicades per un fluid fins a arribar a un punt on seran il·luminades mitjançant un feix de llum làser focalitzat. Les propietats mesurades inclouen la grandària relativa de les partícules, la complexitat relativa o granularitat, així com la intensitat de fluorescència relativa.

Microscòpia Confocal

És una tècnica d'obtenció d'imatges d'alta resolució amb capacitat de seccionat òptic, és a dir, capacitat per adquirir imatges en focus a diferents profunditats de la mostra, i pot mostrar la reconstrucció 3D de la mostra. L'estudi que es pot fer a partir de les imatges és molt variat: anàlisi espectral, anàlisi temporal (evolució d'una mostra en el temps), col·localització, etc.

Electroforesi Capil·lar

L’electroforesi capil·lar permet separar molècules carregades que estan presents en una dissolució en funció de la seua relació massa/càrrega, mitjançant l’aplicació d’un camp elèctric constant al temps que la mostra passa a través d’un capil·lar. Entre els avantatges d’aquesta tècnica trobem la senzillesa d’operació, la rapidesa de les anàlisis, la eficiència i el baix consum de mostra. Aquests avantatges fan que aquesta tècnica siga de molta utilitat en àmbits tan diversos com la química, la biologia, la bioquímica o la medicina, entre altres.

Prestacions

Citometria de flux

El citòmetre de flux permet la caracterització de partícules per mitjà d'un sistema òptic-electrònic que registra tant la dispersió de la llum, com la fluorescència emesa al pas de la partícula pel punt d'interrogació. Es distingeixen tres sistemes principals: sistema de fluids, sistema òptic i sistema electrònic.

En el sistema de fluids la mostra és injectada en el centre d'un raig de fluid ("sheat fluid") que la condueix a la cambra de flux. El disseny d'aquesta cambra de flux ("flow cell") fa que la mostra es mantinga en el centre del flux, a la regió anomenada "sample core", que condueix les partícules alineades fins al punt d'interrogació. Ací té lloc la interacció de les partícules, una per una, amb la font d'excitació (il·luminació làser). Un flux menor limita a les cèl·lules a passar per una àrea més restringida, això comporta que la il·luminació pel làser siga més uniforme i els esdeveniments siguen adquirits més lentament. Aquest tipus de flux és usat comunament en aplicacions on es requerisca molt bona resolució, com per exemple l'anàlisi de DNA.

L'òptica del sistema consisteix en la il·luminació de la mostra mitjançant un feix làser i la detecció i recol·lecció de la llum dispersada per cada partícula mitjançant fotodetectors. Un fotodíode detecta la llum que travessa les partícules en dispersió frontal (FSC, forward scatter) i diversos tubs fotomultiplicadors (PMTs) detecten la llum dispersada lateralment (SSC, side scatter). El mesurament simultani de les dispersions frontal i lateral permet la diferenciació de tipus cel·lulars sobre la base de les seues característiques de grandària (FSC) i complexitat (SSC). D'altra banda, també es registra la fluorescència de la mostra. Quan la mostra no presenta fluorescència, es pot afegir un fluorocrom a la molècula per a aconseguir que aquesta siga fluorescent. La magnitud del senyal registrat serà proporcional a la quantitat de molècules fluorescents en la cèl·lula o partícula. És possible analitzar cèl·lules provinents de teixits sòlids, però es requereix preparar una suspensió. Permet caracteritzar partícules en suspensió d'entre 0.2 i 150 μm de diàmetre.

El sistema electrònic converteix els senyals de llum detectada en senyals electrònics, digitalitza les dades perquè puguen ser processats per un ordinador. Les dades de citometria de flux s'emmagatzemen d'acord amb un format estàndard: el flow Cytometry standard (FCS), desenvolupat per la “Society for Analytical Cytology”. D'acord amb aquest estàndard, l'arxiu emmagatzemat inclou una descripció de la mostra adquirida, l'instrument en el qual es fa l'adquisició, els resultats de l'anàlisi i les dades en si mateixos.

Microscòpia Confocal

La microscòpia confocal de rastreig làser (CLSM, confocal làser scanning microscopy) és una tècnica d'obtenció d'imatges d'alta resolució amb capacitat de seccionat òptic, és a dir, capacitat per adquirir imatges en focus a diferents profunditats de la mostra.

Mentre que un microscopi convencional captura informació de les diferents capes de la mostra en una sola imatge, el microscopi confocal pot obtenir imatge amb informació d'una sola capa. Això és possible gràcies a l'ús d'un pinhole (petita obertura) que elimina la informació de fora de focus en cada punt de la imatge. Es realitza un rastreig punt a punt sobre un pla de la mostra utilitzant radiació làser. Aquests punts formaran la imatge 2D reconstruïda en un ordinador; si mesurem diferents plans de profunditat de la mostra podrem reconstruir imatges 3D.

Aquesta tècnica s'utilitza típicament per a estudis en el camp de la biologia i medicina. Mitjançant l'ús de marcadors fluorescents en les mostres, s'obtenen imatges d'allò que es vol veure.

El microscopi disposa de làsers en l'UV, VIS i IR per il·luminar la mostra i es pot triar el rang espectral a detectar. La configuració del microscopi confocal és invertida, per tant les mostres han de tenir el cubre molt bé segellat.

 L'equip té 5 detectors: 3 PMT (PhotoMultiplier Tube) i un detector híbrid HyD (Hybrid Detector) per mesurar en reflexió; i un PMT per mesurar en transmissió. El detector HyD és capaç de mesurar senyals molt febles, ja que és més eficient en la detecció i redueix el soroll respecte a un PMT.

Imatges per reflexió:

  • En mostres no opaques podem obtenir imatges de diferents plans de profunditat, amb el que pot aconseguir-se informació de les estructures interiors de la mostra.
  • En mostres opaques, el microscopi confocal pot utilitzar-se com a perfilòmetre, per conèixer la superfície de l'objecte d'estudi.

Imatges per transmissió: l'equip compta amb un detector en transmissió, de manera que es poden obtenir imatges de contrast.

Possibilitat d'anàlisi microscòpic de cèl·lules i teixits en condicions in vivo.

Electroforesi Capil·lar

La separació i posterior determinació dels analits d’interès en aquesta tècnica es du a terme mitjançant la separació segons la càrrega dels ions i el registre de l’absorbància mitjançant un detector de díodes (DAD).

El sistema es pot dividir en dos parts principals:

  • Sistema de separació: Format per un capil·lar de sílice fosa, en el qual es du a terme la separació de les partícules carregades mitjançant l’aplicació d’un camp elèctric, que separa les càrregues en funció de la seua massa. A més, l’ús de dissolucions tampó ajuda a la separació dels composts d’interès, assegurant que aquests estan carregats durant l’anàlisi. La versatilitat de l’equip permet treballar amb elevades prestacions en els distints modes d’anàlisi: electroforesi capil·lar de zona (CZE), electrocromatografia capil·lar (CEC), cromatografia electrocinètica micelar (MEKC), electroforesi capil·lar de gel (CGE), isoelectroenfocament capil·lar (CIEF) i isotacoforesi (ITP).

L’equip d’electroforesi compta també amb un sistema automàtic d’introducció de mostra, per la qual cosa facilita l’anàlisi a l’operador fent possible el treball autònom de l’instrument, pel que és un equip ideal per a dur a terme seqüències amb un gran número de mostres

  • Sistema de detecció: En aquest es registra la absorbància UV-Vis dels ions que travessen la finestra de detecció, permetent la mesura de diferents longituds d’ona de forma simultània per l’ús del DAD. A més, les prestacions de l’equip pel que fa a detector, permet l’acoblament a un altre tipus de detectors com l’espectròmetre de masses (MS).

Instrumentació

La instrumentació de la unitat està situada en l'Edifici de Recerca del Campus del Riu Sec de la Universitat Jaume I.

Citometria de flux

Citómetre de Flux BD AccuriTM C6

  • El sistema està equipat amb dos làsers, un blau (488nm) i un altre roig (640nm).
  • Detectors: l'equip consta de 2 detectors de llum dispersada (forward i side) i 4 de llum emesa per la fluorescència. Per a aquests últims, els filtres disponibles són: 533 / 30nm (FITC / GFP), 585 / 40nm (PE / PI),> 670nm (PerCP, PerCP-CyTM5.5, PE-Cy7), 675 / 25nm (ACP), 610 / 20nm, 630 / 30nm, 780 / 60nm.
  • Mesura mínima de partícula detectable: 0.5μm.
  • Volum mínim de la mostra: 300 µl (en tub de 12x75 mm)
  • Taxa d'adquisició de dades: 10000 esdeveniments / segon com a màxim.
  • Màxim d'esdeveniments per mostra: 1 milió d'esdeveniments per mostra.
  • Resolució per difusió: es resolen limfòcits de sang humana perifèrica, monòcits i granulòcits.

Microscòpía Confocal

Microscopi confocal invertit Leica TCS SP8

  • El sistema d'il·luminació confocal consta dels següents làsers: Diode 405, Argon (458, 488, 514), DPSS 561, HeNe 633.
  • Té tres objectius secs: 5x, 10x, 20x; i dos objectius d'immersió en oli: 40x i 63x. La resolució màxima que podem obtenir amb l'objectiu de 63x és 200nm en el pla xy i 500nm en el pla z, que serà també el límit del nostre sistema.
  • Llum de fluorescència Leica EL6000 (OSRAM HXP-R120W / 45C VIS) per mirar pels oculars.
  • Tècniques del microscopi: camp clar (BF, bright field)), polarització (POL), contrast d'interferència diferencial (DIC, differential interference constrast) i fluorescència (FLUO). Aquestes tècniques es poden combinar en una mateixa imatge.
  • Filtres de fluorescència del microscopi: DAPI, FITC, RHOD.
  • El software de l'equip es diu LAS X i permet fer imatge 2D i 3D, imatge espectral, temporal, i la combinació d'elles.

Accessoris:

  • CCD Microscope Camera DFC7000 T per capturar la imatge del que veiem pels oculars. Permet combinar tècniques (FLUO, DIC, etc.) i realitzar un vídeo amb imatges preses cada molt poc temps.
  • CO2 Microscope Cage Incubation System (okolab), per controlar les condicions 'in vivo' (temperatura, CO2, O2) de les mostres.

Electroforesi Capil·lar

Sistema d’electroforesi capil·lar Agilent 7100

  • El sistema està equipat amb llums d'emissió UV-Vis.
  • Detectors: l'equip compta amb un detector de díodes (DAD).

 

Normativa Funcionament (PDF)

Coordinador científic 

Dra. Marta Asunta Miquel Salgado-Araujo. Catedràtica de Psicobiologia. Departament de Psicologia Bàsica, Clinica i Psicobiologia.
 

Personal tècnic

José Miguel Pedra Tellols
Dirección electrónica: pedra@uji.es
 

Ana Belén Vicente Fortea
Dirección electrónica: avicente@uji.es
 

Tarifes

Impresos de sol·licitud 

Informació proporcionada per: Servei Central d'Instrumentació Científica