Quan la radiació infraroja incideix sobre una mostra és capaç de provocar canvis en els estats vibracionals de les molècules que la constitueixen. L'absorció de radiació per part d'una mostra és indicativa del tipus d'enllaços i grups funcionals presents en aquesta.
Des del punt de vista instrumental i de les seues aplicacions és convenient dividir la regió infraroja en tres regions anomenades: infraroig proper (NIR), infraroig mitjà (MIR) i infraroig llunyà (FIR). La gran majoria de les aplicacions analítiques clàssiques de la espectroscòpia infraroja es troben localitzades en les regions de l'infraroig mitjà (4000-400 cm-1) i de l'infraroig proper (12500-4000 cm-1), amb la possibilitat de convertir aquesta tècnica en una tècnica quantitativa. La tècnica de transformada de Fourier, que permet mitjançant una operació matemàtica convertir un espectre en el domini del temps a un espectre en el domini de freqüència, representa una revolució en la espectroscòpia en general i particularment en la infraroja, i permet l'obtenció d'espectres de forma més ràpida, precisa i amb relacions senyal/soroll (S/N) elevades.
La informació que proporciona un espectre d'infraroig és característica de cada substància; per tant, permet caracteritzar molècules amb un cert grau d'especificitat. La tècnica és molt usada per a l'anàlisi qualitativa, però per causa de la seva relativa baixa sensibilitat, ha estat menys utilitzada per anàlisis quantitatives.
L'espectroscòpia Raman es basa en un procés bifotònic en què la radiació incident o excitatriu és dispersada per la mostra que a la seva volta és pertorbada i produeix transicions de tipus vibracional i rotacional.
En general, l'espectre Raman s'interpreta com un espectre vibracional que ofereix informació molt similar a l'espectre d'infraroig, encara que les vibracions que es veuen reflectides en l'espectre Raman no són sempre les mateixes que en aquest, ja que les regles de selecció d'aquesta espectroscòpia són distintes.
Aquesta tècnica pot ser aplicada pràcticament a qualsevol tipus de mostra i és complementària de l'infraroig, ja que vibracions inactives en una d'elles poden ser actives a l’altra.
Quan la llum linealment polaritzada passa a través d'una substància òpticament activa, les seues dues components circularment polaritzades, feixos de llum polaritzats a dreta i esquerra, viatgen a diferents velocitats i són absorbides en diversos graus per la substància. Així doncs, la llum que passa a través de la substància passa a estar el·lípticament polaritzada i es diu que aquesta substància presenta dicroisme circular. Aquesta magnitud se sol expressar en unitats d'el·lipticitat molecular (θ).
Ambdues components estan en fase i són de la mateixa amplitud. En passar per un medi òpticament actiu, cada component interactua de manera diferent amb els centres quirals de les molècules presents. Aquesta interacció indueix un desfasament i un canvi de magnitud diferencials en aquestes components circularment polaritzades de la llum i aquests fenòmens provoquen una rotació del pla de polarització en un angle α, de manera que la distorsió d'aquest pla genera una el·lipse.
La rotació del pla i la diferent absorció de les components circularment polaritzades (dicroisme circular) varien d'acord amb la longitud d'ona i se'n poden obtenir espectres d'aquests fenòmens, és a dir, gràfiques de la rotació o el·lipticitat front a la longitud d'ona. Els espectres de dicroisme circular s'obtenen generalment en les regions de l’ultraviolat proper (250 a 350 nm) i llunyà (180 a 250 nm) de la radiació electromagnètica.
La fluorimetria és una tècnica que permet la mesura de l’emissió de radiació produïda quan un determinat compost químic ha esta prèviament excitat amb una radiació electromagnètica de longitud d’ona adequada.
El fenomen es dona fonamentalment amb molècules que contenen anells aromàtics condensats, encara que el pot presentar qualsevol molècula que continga un sistema π-π* amb rigidesa estructural. L’excitació (l’absorció d’energia electromagnètica) comporta la promoció d’un electró des del nivell electrònic fonamental, π, a un nivell electrònic excitat, π*.
Un cop relaxat qualsevol mode de vibració de l’estat excitat, la rigidesa estructural fa que el mecanisme de desexcitació (tornada a l’estat fonamental) més afavorit (probable) siga l’emissió d’un segon fotó de longitud d’ona generalment major.
Les possibilitats d’obtenir espectres d’excitació i d’emissió i de fer mesures de temps de vida de fluorescència fan que aquesta siga una tècnica selectiva, sensible i que proporciona informació molt útil en l’elucidació d’estructures moleculars.
L’espectroscòpia infraroja és una de les tècniques espectroscòpiques més versàtils i de major aplicació. Les possibles aplicacions d'aquesta tècnica són, per tant, difícils d’enumerar de forma completa. No obstant això, a continuació se citen algunes de les aplicacions més importants:
Caracterització i identificació de materials:
A l’igual que en l’espectroscòpia FTIR, les aplicacions de l’espectroscòpia Raman són molt nombroses. Algunes d’estes s’enumeren a continuació:
La informació que s’obté d’un espectre de dicroisme circular és la disposició relativa de cromòfors en l’espai tridimensional, la qual cosa proporciona una important informació estereoquímica. Per tant, les aplicacions immediates d’aquesta tècnica son:
La fluorimetria és una tècnica que presenta nombroses aplicacions analítiques en camps com ara l’anàlisi orgànica, l’anàlisi bioquímica, química clínica, així com en la investigació biomèdica.
La fluorimetria és també una poderosa ferramenta d’investigació en l’estudi de macromolècules biològiques, amb un nombre elevat d’aplicacions en investigacions sobre polímers sintètics (estudis de distribució d’espècies en sistemes polimèrics, de mobilitat conformacional de cadenes flexibles, de reaccions intermoleculars de reactius macromoleculars controlats per difusió, de comptabilitat polimèrica, etc.).
Espectròmetre d’infraroig per transformada de Fourier FT/IR-6200 (Jasco).
Permet la mesura de les transicions vibracionals moleculars que es troben en l’interval de números d’ona de 7500 cm-1 fins a 375 cm-1. Presenta una resolució màxima de 0.25 cm-1 i una relació S/N de 45000:1.
En aquest equip es poden mesurar les mostres mitjançant ATR gràcies a la utilització del dispositiu ATR Pro One (Jasco), amb cristall de diamant, que permet mesurar en el rang de 5000 cm-1 a 400 cm-1.
L’equip està acoblat a un microscopi d’infraroig model IRT-3000 (Jasco). Aquest microscopi permet l’observació (IR imaging) tant per reflexió com per transmissió gràcies a l’objectiu x16 de tipus Cassegrain. En la zona observada, es poden mesurar les transicions vibracionals en l’interval de 4000 a 600 cm-1. Permet també realitzar mapatges de les transicions a l’IR, amb moviment en les direccions de l’espai xy, perpendiculars al feix de radiació IR.
Espectròmetre d’infraroig per transformada de Fourier Equinox 55 (Bruker).
Permet la mesura de les transicions vibracionals moleculars que es troben en el rang de números d’ona de 8000 cm-1 fins a 350 cm-1, amb una resolució màxima de 0.5 cm-1.
Microscopi confocal Raman apyron (Witec)
Sistema modular Raman de la companyia WITec GmbH. Microscopi confocal vertical automàtic model apyron. El sistema utilitza tres fonts làser connectades mitjançant fibra òptica per excitar les mostres (457 nm, 532 nm i 785 nm) amb filtres de pas llarg i dos espectròmetres optimitzats, el primer per al rang del visible amb detector d’ultra-alta eficiència EMCCD i el segon per al NIR amb detector d’alta eficiència CCD.
El microscopi confocal permet la discriminació de la informació provinent de zones de la mostra fora de focus i l’obtenció de mapatges tant en superfície (xy), en profunditat (xz) com tridimensionals (xyz) mitjançant una taula motoritzada, amb passos mínims de 100 nm en xy i 10 nm en z.
Està equipat amb diversos objectius òptics Zeiss (x10, x20 LD, x50 LD, x100 (LD: llarga distància focal)) per a l’estudi de les mostres. També disposa d’un objectiu Zeiss d’immersió en aigua (x63) especialment indicat per a l’estudi de mostres amb o en aigua, com cèl·lules i teixits biològics.
Addicionalment, l’equip està dotat d’un control de potència que permet increments de 0.1mW i és aplicable a tots els làsers, així com el sistema de reconeixement topogràfic de superfície TrueSurface per aconseguir la mesura degudament enfocada de mostres amb superfícies irregulars.
Espectròmetre NRS-3100 (Jasco)
Espectròmetre Raman dispersiu model NRS-3100 (Jasco) dotat d’un microscopi òptic i un detector CCD refrigerat per aire. Permet la mesura de les transicions Raman en el interval de 100 a 4000 cm-1, amb una resolució de 4 cm-1. Té dues fonts làser d’excitació, a 633 nm i 785 nm.
Per a l’estudi de les mostres es poden utilitzar tres objectius òptics Olympus amb magnificacions x5, x20 i x100.
Permet realitzar un mapatge de les transicions Raman, amb moviment en les tres direccions de l’espai gràcies a la taula motoritzada.
Espectropolarímetre CD-ORD J-1500 (Jasco)
Espectropolarímetre J-1500 (Jasco) equipat amb un sistema de control de temperatura Peltier per a mostres líquides (amb rang de treball de -40º a +130º C) i làmpada de xenó de 450W refrigerada per aigua.
Aquest equip permet mesurar la desviació de la radiació electromagnètica circularment polaritzada (Dicroisme Circular) en l'interval de longituds d’ona NIR-visible-ultraviolada (de 170 nm a 1600 nm). L’adquisició d’espectres de Dicroisme Circular va acompanyada de l’adquisició paral·lela de l’espectre d’Absorció UV-Vis i estos poden adquirir-se simultàniament a l'espectre d'Emissió de Fluorescència a una longitud d'ona determinada.
Així mateix, l’instrument també es pot usar, emprant l'accessori adequat, per mesurar directament la Dispersió Òptica Rotatòria (ORD) o Poder Òptic Rotatori.
A més de mostres líquides, es pot utilitzar també per a l’estudi de mostres sòlides gràcies a l’esfera integradora de Spectralon, amb un rang de treball en longitud d’ona de 200 nm a 900 nm.
Per altra banda, addicionalment permet fer estudis de baixa resolució de la fluorescència dels materials, tant d’emissió com d’absorció (amb una resolució màxima per a la longitud d’ona de 10 nm).
Espectrofluorímetre amb resolució temporal o single photon counting (SPC, recompte de fotons únics) model IBH-5000-U (JOBIN YVON HORIBA).
Està equipat amb una font de llum polsada de nanosegons (làmpada d’hidrogen), monocromadors d’excitació i detector amb sensibilitat en un ampli interval de longituds d’ona.
La tècnica SPC permet la mesura de temps de vida d’estats excitats d’emissió en sistemes moleculars i macromoleculars.
Espectrofluorímetre en estat estacionari model Fluorolog 3-11 (Spex).
Equipat amb una font de llum policromàtica consistent en una làmpada de xènon de 450 W de potencia, monocromadors d’excitació i emissió, portamostres termostatitzat mitjançant recirculació i mostrejador automàtic per a valoracions automàtiques.
L’equip permet l’adquisició d’espectres d’excitació i emissió, així com determinar rendiments quàntics de fluorescència.
Dr. Eduardo García-Verdugo Cepeda. Departament Química Inorgànica i Orgànica.
José Miguel Pedra Tellols
Dirección electrónica: pedra@uji.es