Citometria de flux
La citometria de flux es basa a mesurar i analitzar simultàniament múltiples característiques de partícules individuals en suspensió, normalment cèl·lules, mentre aquestes circulen embolicades per un fluid fins a arribar a un punt on seran il·luminades mitjançant un feix de llum làser focalitzat. Les propietats mesurades inclouen la grandària relativa de les partícules, la complexitat relativa o granularitat, així com la intensitat de fluorescència relativa.
Microscòpia Confocal
És una tècnica d'obtenció d'imatges d'alta resolució amb capacitat de seccionat òptic, és a dir, capacitat per adquirir imatges en focus a diferents profunditats de la mostra, i pot mostrar la reconstrucció 3D de la mostra. L'estudi que es pot fer a partir de les imatges és molt variat: anàlisi espectral, anàlisi temporal (evolució d'una mostra en el temps), col·localització, etc.
Electroforesi Capil·lar
L’electroforesi capil·lar permet separar molècules carregades que estan presents en una dissolució en funció de la seua relació massa/càrrega, mitjançant l’aplicació d’un camp elèctric constant al temps que la mostra passa a través d’un capil·lar. Entre els avantatges d’aquesta tècnica trobem la senzillesa d’operació, la rapidesa de les anàlisis, la eficiència i el baix consum de mostra. Aquests avantatges fan que aquesta tècnica siga de molta utilitat en àmbits tan diversos com la química, la biologia, la bioquímica o la medicina, entre altres.
Citometria de flux
El citòmetre de flux permet la caracterització de partícules per mitjà d'un sistema òptic-electrònic que registra tant la dispersió de la llum, com la fluorescència emesa al pas de la partícula pel punt d'interrogació. Es distingeixen tres sistemes principals: sistema de fluids, sistema òptic i sistema electrònic.
En el sistema de fluids la mostra és injectada en el centre d'un raig de fluid ("sheat fluid") que la condueix a la cambra de flux. El disseny d'aquesta cambra de flux ("flow cell") fa que la mostra es mantinga en el centre del flux, a la regió anomenada "sample core", que condueix les partícules alineades fins al punt d'interrogació. Ací té lloc la interacció de les partícules, una per una, amb la font d'excitació (il·luminació làser). Un flux menor limita a les cèl·lules a passar per una àrea més restringida, això comporta que la il·luminació pel làser siga més uniforme i els esdeveniments siguen adquirits més lentament. Aquest tipus de flux és usat comunament en aplicacions on es requerisca molt bona resolució, com per exemple l'anàlisi de DNA.
L'òptica del sistema consisteix en la il·luminació de la mostra mitjançant un feix làser i la detecció i recol·lecció de la llum dispersada per cada partícula mitjançant fotodetectors. Un fotodíode detecta la llum que travessa les partícules en dispersió frontal (FSC, forward scatter) i diversos tubs fotomultiplicadors (PMTs) detecten la llum dispersada lateralment (SSC, side scatter). El mesurament simultani de les dispersions frontal i lateral permet la diferenciació de tipus cel·lulars sobre la base de les seues característiques de grandària (FSC) i complexitat (SSC). D'altra banda, també es registra la fluorescència de la mostra. Quan la mostra no presenta fluorescència, es pot afegir un fluorocrom a la molècula per a aconseguir que aquesta siga fluorescent. La magnitud del senyal registrat serà proporcional a la quantitat de molècules fluorescents en la cèl·lula o partícula. És possible analitzar cèl·lules provinents de teixits sòlids, però es requereix preparar una suspensió. Permet caracteritzar partícules en suspensió d'entre 0.2 i 150 μm de diàmetre.
El sistema electrònic converteix els senyals de llum detectada en senyals electrònics, digitalitza les dades perquè puguen ser processats per un ordinador. Les dades de citometria de flux s'emmagatzemen d'acord amb un format estàndard: el flow Cytometry standard (FCS), desenvolupat per la “Society for Analytical Cytology”. D'acord amb aquest estàndard, l'arxiu emmagatzemat inclou una descripció de la mostra adquirida, l'instrument en el qual es fa l'adquisició, els resultats de l'anàlisi i les dades en si mateixos.
Microscòpia Confocal
La microscòpia confocal de rastreig làser (CLSM, confocal làser scanning microscopy) és una tècnica d'obtenció d'imatges d'alta resolució amb capacitat de seccionat òptic, és a dir, capacitat per adquirir imatges en focus a diferents profunditats de la mostra.
Mentre que un microscopi convencional captura informació de les diferents capes de la mostra en una sola imatge, el microscopi confocal pot obtenir imatge amb informació d'una sola capa. Això és possible gràcies a l'ús d'un pinhole (petita obertura) que elimina la informació de fora de focus en cada punt de la imatge. Es realitza un rastreig punt a punt sobre un pla de la mostra utilitzant radiació làser. Aquests punts formaran la imatge 2D reconstruïda en un ordinador; si mesurem diferents plans de profunditat de la mostra podrem reconstruir imatges 3D.
Aquesta tècnica s'utilitza típicament per a estudis en el camp de la biologia i medicina. Mitjançant l'ús de marcadors fluorescents en les mostres, s'obtenen imatges d'allò que es vol veure.
El microscopi disposa de làsers en l'UV, VIS i IR per il·luminar la mostra i es pot triar el rang espectral a detectar. La configuració del microscopi confocal és invertida, per tant les mostres han de tenir el cubre molt bé segellat.
L'equip té 5 detectors: 3 PMT (PhotoMultiplier Tube) i un detector híbrid HyD (Hybrid Detector) per mesurar en reflexió; i un PMT per mesurar en transmissió. El detector HyD és capaç de mesurar senyals molt febles, ja que és més eficient en la detecció i redueix el soroll respecte a un PMT.
Imatges per reflexió:
Imatges per transmissió: l'equip compta amb un detector en transmissió, de manera que es poden obtenir imatges de contrast.
Possibilitat d'anàlisi microscòpic de cèl·lules i teixits en condicions in vivo.
Electroforesi Capil·lar
La separació i posterior determinació dels analits d’interès en aquesta tècnica es du a terme mitjançant la separació segons la càrrega dels ions i el registre de l’absorbància mitjançant un detector de díodes (DAD).
El sistema es pot dividir en dos parts principals:
L’equip d’electroforesi compta també amb un sistema automàtic d’introducció de mostra, per la qual cosa facilita l’anàlisi a l’operador fent possible el treball autònom de l’instrument, pel que és un equip ideal per a dur a terme seqüències amb un gran número de mostres
La instrumentació de la unitat està situada en l'Edifici de Recerca del Campus del Riu Sec de la Universitat Jaume I.
Citometria de flux
Citómetre de Flux BD AccuriTM C6
Microscòpía Confocal
Microscopi confocal invertit Leica TCS SP8
Accessoris:
Electroforesi Capil·lar
Sistema d’electroforesi capil·lar Agilent 7100
Dra. Marta Asunta Miquel Salgado-Araujo. Catedràtica de Psicobiologia. Departament de Psicologia Bàsica, Clinica i Psicobiologia.
José Miguel Pedra Tellols
Dirección electrónica: pedra@uji.es
Ana Belén Vicente Fortea
Dirección electrónica: avicente@uji.es