Universitat Jaume I - UJI - Castello

Investigaciones Analíticas

Líneas de Investigación

• Impacto de los plaguicidas sobre la calidad de las aguas.
• Investigación sobre nuevos contaminantes en aguas: fármacos y hormonas.
• Aplicaciones de técnicas híbridas cromatografía/espectrometría de masas en la cuantificación, confirmación y elucidación de contaminantes orgánicos en muestras de interés ambiental, alimentario y toxicológico.
• Estudios de exposición de la población a plaguicidas: metabolismo en seres humanos.
• Estudios sobre acuicultura, con especial énfasis en la toxicidad, bioacumulación y biomagnificación de plaguicidas y compuestos clorados en organismos marinos.
• Determinación de toxinas marinas en organismos marinos. estudio de su ecotoxicocinética en bivalvos. aplicación de fármacos para la depuración de xenobióticos en especies de interés.

Impacto de los plaguicidas sobre la calidad de las aguas

Se trata de una de las principales actividades desarrolladas por el antiguo GIMARN. Esta línea de trabajo dio lugar a varios convenios de colaboración y proyectos de investigación. Entre estos, cabe destacar los sucesivos convenios con la Conselleria de Agricultura y Pesca de la Generalitat Valenciana sobre Residuos de plaguicidas en aguas naturales que, a lo largo de la década de los años 90, permitió un mejor conocimiento del estado de contaminación de las aguas de la Comunidad Valenciana, tanto superficiales como subterráneas. También relevantes fueron los estudios realizados por encargo del Instituto Geológico y Minero de España (IGME). El primero de ellos, Estudios de contaminación de aguas subterráneas por plaguicidas. Determinación de residuos, evolución y procesos físico-químicos en las zonas saturada y no saturada, permitió tener un mejor conocimiento de la movilidad de plaguicidas seleccionados en suelo y en ZNS, así como de las posibilidades de contaminación de las aguas subterráneas en el área citrícola de la Comunidad Valenciana. A través de un segundo estudio, Investigación de plaguicidas en las aguas subterráneas de la vega media-baja del río Segura, se pudieron establecer las zonas más vulnerables frente a la contaminación por plaguicidas en esta área de Murcia, de amplia tradición agrícola.

La problemática de la contaminación de aguas por plaguicidas también se ha abordado en varios proyectos. En un primer proyecto de la CICYT, en el año 1991, se abordó el estudio de la Contaminación de origen agrícola en el subsistema acuífero de la Plana de Castellón, obteniéndose datos de interés sobre la presencia de plaguicidas y de nitratos en dichas aguas. Posteriormente, el proyecto de la UE Development of Analytical and Sampling Methods for Priority Pesticides and Relevant Transformation Products in Acuifers, Environment 1991-94, mediante sendos convenios con la Universitat Politècnica de Catalunya y con la Consejería de Obras Publicas, Vivienda y Aguas (Dirección General de Aguas) del Gobierno de Canarias, permitió realizar numerosas experiencias de campo y de laboratorio con el fin de investigar la presencia de plaguicidas prioritarios y de sus principales productos de transformación en acuíferos de Canarias y de Cataluña.

En fechas más recientes, se ha profundizado en este tema a través de proyectos como: Aprovechamiento de nuevos avances en instrumentación analítica para la realización de estudios sobre el impacto de residuos de plaguicidas en la calidad de las aguas subterráneas, del Programa nacional de recursos naturales, Ministerio de Ciencia y Tecnología, 2003-2005 y Establecimiento de un programa de vigilancia e investigación de residuos de plaguicidas en aguas subterráneas de la Comunidad Valenciana, proyecto de investigación Universitat Jaume I-Fundació Caixa Castelló, 2002-2003. Estos proyectos presentan gran interés en áreas de intensa actividad agrícola, con amplio uso de plaguicidas, que además, posean acuíferos vulnerables que puedan estar sometidos a contaminación por plaguicidas. El desarrollo de metodología analítica moderna, sensible y fiable, para compuestos que, por sus características físico-químicas (elevada polaridad y solubilidad en agua, principalmente), presentan mayor movilidad en el suelo y en la zona no saturada (principalmente herbicidas de diversas familias químicas) es una de las tareas más complicadas de esta línea de investigación. El aspecto más relevante es, sin duda, el diseño de un programa de vigilancia de plaguicidas y productos de transformación en aguas subterráneas, en el que queden claramente indicados los compuestos objeto de control y los métodos analíticos que deben aplicarse para su detección a niveles inferiores a 0,1 µg/L (límite máximo permitido para aguas de abastecimiento público). La adecuada selección de los compuestos a controlar deberá basarse en factores como: grado de utilización de los plaguicidas en las zonas investigadas, persistencia de los plaguicidas frente a la hidrólisis, movilidad en suelo y zona no saturada, toxicidad, datos previos sobre su detección en las áreas controladas, etc. En última instancia, se pretende proponer las líneas maestras que permitan diseñar un programa de control, vigilancia en investigación de plaguicidas en el ámbito nacional, y aplicar la metodología de trabajo desarrollada a la Comunidad Valenciana con el fin de conocer el estado actual de sus aguas subterráneas en lo referente a una problemática poco conocida como es la contaminación por plaguicidas.

A finales de 2003, se inició una línea de trabajo relacionada con la problemática ambiental de los plaguicidas, sobre la base del proyecto Aplicación del acoplamiento cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS y LC-QTOF-MS) a la identificación de metabolitos de plaguicidas en muestras de interés ambiental y toxicológico, del Ministerio de Ciencia y Tecnología. Se trata de explorar las posibilidades de las poderosas técnicas analíticas de MS (de triple cuadrupolo, tiempo de vuelo, y analizador híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo) acopladas a LC, con el fin de investigar la presencia de plaguicidas, productos de transformación y, especialmente, compuestos desconocidos en aguas, con especial énfasis en la identificación y confirmación de su identidad siguiendo las pautas recientes de la UE.

Desde hace más de una década, se mantiene una línea de investigación conjunta con el Laboratory of Organic Analytical Chemistry, Institute of Public Health and Environment (RIVM), Bilthoven, Holanda, sobre nuevos avances analíticos para la evaluación de la contaminación por compuestos orgánicos en el medio ambiente. En este contexto se han realizado alrededor de diez estancias de investigación en el RIVM y en la UJI para llevar a cabo trabajos conjuntos.

Investigación sobre nuevos contaminantes en aguas: fármacos y hormonas

Hasta fechas muy recientes, la relevancia medioambiental de los fármacos y de las hormonas, tanto naturales como sintéticas, no había sido tenida en cuenta, ya que estos compuestos sólo se estudiaban en términos de salud humana y veterinaria, y no se prestaba atención a su entrada y potencial impacto sobre el medio ambiente.

La mayoría de estos compuestos se excretan por los seres humanos y entran en el medioambiente después de alguna forma de tratamiento, generalmente en una estación depuradora de aguas residuales (EDAR). Las EDAR modernas se han diseñado como herramientas muy eficaces para tratar los problemas de exceso de nutrientes y contaminación microbiológica. Sin embargo, un gran número de compuestos naturales y sintéticos todavía se encuentran presentes en los efluentes, ya que no han podido ser eliminados eficazmente por estos sistemas y, finalmente, llegan al medioambiente a través de las aguas depuradas.

Entre estos compuestos se pueden encontrar los fármacos y las hormonas, que a pesar de haber sido ampliamente estudiados en humanos y otros mamíferos durante las fases de desarrollo y posterior registro requeridas por la mayoría de las agencias gubernamentales, existe falta de información ecotoxicológica sobre estos compuestos, así como su relevancia en el medioambiente.

Estos compuestos han sido diseñados para ser altamente activos y específicos en receptores humanos, por lo que una vez han sido introducidos en el medioambiente pueden interactuar con los sistemas biológicos de multitud de organismos.

La peligrosidad de las hormonas queda patente por su inherente capacidad disruptora endocrina, por lo que la emisión de hormonas, tanto naturales como sintéticas, en los efluentes de las EDAR puede producir impactos negativos sobre los seres vivos expuestos en los compartimentos medioambientales receptores.

En cuanto a los fármacos, en esta nueva línea de investigación, nuestros estudios se han centrado inicialmente en los antibióticos debido a su relevancia y sus potenciales efectos, como el posible aumento de la aparición de resistencias en bacterias y microorganismos expuestos a estos compuestos a través de las aguas.

Los estudios de evaluación del riesgo medioambiental combinan la peligrosidad con la posibilidad de exposición, basándose en las concentraciones medioambientales predecibles (PEC) y datos de laboratorio. Sin embargo, los niveles de concentración medidos (MEC) son indispensables para obtener datos reales, así como detalles de la evolución de los fármacos en diferentes compartimentos medioambientales.

Consecuentemente, el desarrollo de métodos analíticos sensibles y selectivos en matrices medioambientales, como las aguas, es de gran importancia para evaluar correctamente su posible riesgo.

Para alcanzar los límites de detección necesarios, en el orden de los ng/L, se requieren elevados factores de preconcentración y/o métodos de detección extremadamente sensibles, casi siempre basados en acoplamientos cromatografía-espectrometría de masas. Por lo tanto, una simple modificación de los métodos analíticos desarrollados durantes los estudios clínicos del fármaco no es suficiente para su aplicación a muestras medioambientales. El análisis de fármacos y hormonas en aguas residuales, superficiales y subterráneas requiere del desarrollo de nuevos métodos analíticos que permitan alcanzar límites de detección en el rango de unos pocos ng/L.

El primer informe sobre la aparición de residuos de fármacos en el medio ambiente fue publicado por Garrison, en 1976, de la Agencia de Protección Medioambiental de los Estados Unidos de América (USA EPA), que encontraron ácido clofíbrico y ácido salicílico en las aguas depuradas de una EDAR a niveles de 1-2 µg/L. Emplearon extracción líquido-líquido con diclorometano, metilación con diazometano y posterior detección por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Sin embargo, esta publicación no inició nuevas investigaciones sobre la aparición y relevancia de los fármacos en el medio ambiente hasta la década siguiente, donde aparecen en Europa los primeros estudios en profundidad sobre el impacto de los fármacos en el medioambiente. Estos trabajos demostraron que en el Reino Unido existían niveles de fármacos del orden del µg/L en las aguas; sin embargo, los métodos empleados seguían estando basados en GC-MS con las consiguientes etapas de tratamiento de muestra (extracción, derivatización y purificación) previas a la inyección el sistema GC-MS.

Sin embargo, muchos fármacos y hormonas, por su elevada polaridad, no son analitos adecuados para su determinación por GC-MS. Con la generalización de las interfases a presión atmosférica (API), se ha popularizado el uso de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) y se han empezado a desarrollar métodos para fármacos y hormonas en aguas basados en LC-MS. Además, debido a los bajos niveles de concentración esperados de estos contaminantes, se suelen preconcentrar volúmenes de agua del orden de un litro hasta extractos finales del orden de un mililitro, alcanzando factores de preconcentración de tres órdenes de magnitud.

A pesar de que todavía se pueden encontrar ciertas aplicaciones empleando un sistema LC-MS, basadas en un único analizador de filtro cuadrupolar, la complejidad de las muestras y los bajos límites de detección necesarios hacen que casi todas las aplicaciones desarrolladas se basen en el empleo de un sistema LC-MS/MS, principalmente con un analizador de triple cuadrupolo, aunque también se pueden encontrar aplicaciones recientes con sistemas de trampa de iones.

Sin embargo, en casi todos los casos, se sigue realizando una etapa de preconcentración manual de entre 250-1.000 mL de muestra de agua mediante extracción en fase sólida en modo «off-line». Durante esta fase del procedimiento se pueden producir errores, pérdidas de analito por alcanzar el volumen de ruptura del mismo o colmatación del cartucho por coextracción de interferentes presentes en la muestra de agua.

El uso de un sistema de extracción en fase sólida acoplado en línea al de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (SPE-LC-MS/MS) se ha aplicado satisfactoriamente por investigadores del IUPA en otros ámbitos del análisis de microcontaminantes orgánicos en aguas, permitiendo reducir el volumen de muestra a preconcentrar a unos pocos mililitros (1-4 mL), minimizando las pérdidas por ruptura, reduciendo la coextracción de interferentes y permitiendo alcanzar fácilmente límites de detección del orden de los pocos ng/L, e incluso, para analitos favorables, de sub-ng/L. Estas ventajas se pueden aplicar también en el desarrollo de metodología para otros contaminantes orgánicos, como los fármacos y las hormonas. Para esta última familia de compuestos existen algunas aplicaciones en este sentido, pero utilizando detección ultravioleta, con la consiguiente pérdida de selectividad y sensibilidad frente a un espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo, requiriéndose la preconcentración de mayores volúmenes de muestra (200 mL).

Otro aspecto muy importante a tener en cuenta cuando se desarrolla metodología analítica para la determinación de contaminantes orgánicos en aguas es la capacidad de confirmación del método ante una muestra positiva. De hecho ha habido fuertes polémicas ante datos sobre la presencia de fármacos y hormonas en las aguas de Estados Unidos, difíciles de rebatir por la falta de métodos de confirmación para muchas muestras positivas. La mayoría de los métodos desarrollados hacen énfasis en la sensibilidad alcanzada, pero muy pocos profundizan en la necesidad de confirmar correctamente la identidad del compuesto detectado. En la presente línea de trabajo, la confirmación adecuada de la presencia de residuos de fármacos y hormonas en las muestras de agua es un aspecto crucial, para evitar falsos positivos. Para ello, y basándose en una reciente Decisión de la Unión Europea (2002/657/CE) sobre la identificación y cuantificación de residuos en productos de origen animal, se estudian las posibilidades confirmatorias que ofrecen las técnicas de espectrometría de masas en tándem, tanto de triple cuadrupolo como de cuadrupolo-tiempo de vuelo, para la confirmación de residuos de antibióticos y hormonas en aguas. En relación con este aspecto, el uso de la tecnología de tiempo de vuelo (TOF) o mejor aún, el híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) ya se ha empezado a utilizar en el ámbito medioambiental para la identificación y confirmación de residuos de contaminantes o de sus productos de transformación.

Aplicaciones de técnicas híbridas cromatografía/espectrometría de masas en la cuantificación, confirmación y elucidación de contaminantes orgánicos en muestras de interés ambiental, alimentario y toxicológico

Se trata de una línea de investigación con una fuerte componente analítica en la que se explora el potencial de las más modernas técnicas analíticas acopladas a espectrometría de masas. Esta línea tiene interconexiones con los otros ámbitos de investigación, también descritos en la presente Memoria de actividades, en los cuales se hace uso de métodos avanzados con fines aplicados. Cabe distinguir, en este ámbito, dos grandes grupos de técnicas híbridas: cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). En ambos casos, se hace uso de equipos instrumentales equipados con diversos analizadores de MS. En cuanto a GC-MS se trabaja con equipos de un solo cuadrupolo (Q), trampa de iones (IT), triple cuadrupolo (QqQ) y tiempo de vuelo (TOF). En cuanto a LC-MS se dispone de analizadores tipo QqQ y del analizador híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF). La instrumentación disponible permite investigar el potencial y aplicaciones de técnicas MS en tándem, tanto en gases (GC-MS/MS) como en líquidos (LC-MS/MS), pudiendo utilizar equipos que permiten la medida de masa nominal, o bien de masa exacta, en el caso de los equipos de alta resolución TOF-MS.

Nuestras principales aportaciones en este ámbito se han centrado en la simplificación en el tratamiento de muestra y en la mejora de características analíticas relevantes, como sensibilidad y selectividad, que son fundamentales en la determinación de microcontaminantes orgánicos. Se ha puesto especial énfasis en la determinación de compuestos de conocida dificultad analítica, como herbicidas fosfónicos (glifosato, glufosinato), compuestos en forma iónica, como el fosetil, y especialmente en los metabolitos y productos de transformación (TP) de plaguicidas, como alquilfosfatos, diversos metabolitos conjugados (glucurónidos), AMPA, etc. Las principales aproximaciones analíticas empleadas para este fin han sido el uso de la cromatografía líquida con columnas acopladas (LC-LC, SPE-LC), la inyección de grandes volúmenes, tanto en GC como en LC, y la microextracción en fase sólida (SPME), en todos los casos en combinación con técnicas híbridas cromatografía/MS(MS) con la amplia variedad de analizadores mencionados anteriormente.

Las muestras objeto de estudio son muy diversas y abarcan el ámbito ambiental (aguas, suelos y sedimentos), alimentario (principalmente productos vegetales) y toxicológico (fluidos biológicos, tejido adiposo humano, tumores, etc.). En cuanto a los analitos, dadas las características de nuestro grupo, el trabajo se centra principalmente en el ámbito de los plaguicidas y sus metabolitos, aunque también se contemplan otras problemáticas como la de compuestos clorados persistentes (OC y PCB), difeniléter bromados (PDEB), hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH) y, más recientemente, fármacos de diversos tipos y toxinas marinas, entre otros.

Nuestro trabajo ha contado con el soporte de  varios proyectos y contratos nacionales e internacionales de investigación, en los que ha existido una intensa colaboración con grupos extranjeros, pudiendo destacar el National Institute of Public Health and Environment (RIVM), Bilthoven, Holanda. Todo ello ha conducido a la publicación de unos 100 artículos científicos en revistas ISI y a la defensa de diez tesis doctorales, las tres últimas con mención de doctorado europeo.

En los últimos años, se ha prestado especial atención a la problemática de la identificación-confirmación de los compuestos detectados en muestras reales, especialmente cuando se utilizan técnicas basadas en LC-MS y LC-MS/MS. Asimismo, se ha investigado en detalle los efectos que la matriz ejerce sobre la ionización en LC-MS, ya que en ciertos casos pueden llegar a causar graves problemas en la cuantificación, bien por supresión de la ionización del analito o bien por exaltación. Otro aspecto que se está abordando en la actualidad es la identificación/elucidación de compuestos desconocidos (non-target analytes) en muestras ambientales, así como la posibilidad de desarrollar métodos amplios de cribado (screening) en donde los analitos pueden ser seleccionados a priori (pre-target analysis) o a posteriori, una vez adquiridos todos los datos (post-target analysis). En este ámbito, es donde los analizadores TOF y Q-TOF muestran un excelente potencial.

Todos estos temas han sido abordados con cierto detalle en algunas de nuestras publicaciones más recientes en artículos sobre tendencias (publicados en la revista Trends Anal. Chem.) o en revisiones críticas sobre el estado del arte (dos reseñas publicadas en Anal. BioAnal. Chem.).

En nuestro trabajo se ha puesto de manifiesto el potencial de la técnica LC-MS/MS QqQ en análisis de residuos de plaguicidas (PRA). Se trata de una técnica excelente para la correcta cuantificación y confirmación de plaguicidas polares y TP en el análisis de compuestos diana (target analysis).

Por otro lado, la confirmación de la identidad de los compuestos detectados en muestras reales puede ser complicada y poco fiable cuando se usa la técnica LC-MS, por lo que es de vital importancia la aplicación de criterios rigurosos de confirmación para evitar falsos positivos y/o falsos negativos en los análisis. El criterio basado en el uso de puntos de identificación (IP) (Decisión europea 2002/657/EC) es uno de los más útiles y ampliamente aceptados en la actualidad. En un estudio comparado sobre el potencial y aplicabilidad de distintos analizadores MS acoplados a LC con fines de confirmación, hemos puesto de manifiesto la importancia que tiene no sólo alcanzar un número determinado de IP en los análisis, sino también la especificidad de las transiciones MS/MS seleccionadas en métodos basados en LC tándem MS.

Son de gran interés los estudios de elucidación de metabolitos y TP, formados en muestras de agua bajo condiciones de laboratorio, ya que permiten conocer los compuestos más relevantes e incluirlos posteriormente en los métodos analíticos desarrollados, basados, por ejemplo, en el uso de LC-MS/MS QqQ. La aplicación de estos métodos a muestras reales de agua ha permitido en nuestro caso detectar numerosos TP en las muestras analizadas, en ocasiones a concentraciones superiores a los de los plaguicidas inalterados (parent compound). La técnica LC-QTOF es muy poderosa para la elucidación de metabolitos y TP en los experimentos realizados en laboratorio. Este hecho se ha comprobado para herbicidas triazínicos (estudios de fotodegradación) y para el insecticida diazinón (estudios de fotodegradación y de metabolismo, in vivo e in vitro). Los datos de masa exacta aportados por TOF-MS permiten diferenciar entre compuestos isobáricos y asignar una única fórmula empírica, en la mayoría de los casos, con excelente sensibilidad. La posibilidad de trabajar en tándem MS con los equipos de QTOF es de gran ayuda para diferenciar entre isómeros de TP.

La elucidación de compuestos no diana (non target) en muestras ambientales es un reto complicado para los químicos analíticos. En el caso de compuestos polares, difícilmente analizables por GC, la técnica LC-TOF MS aparece como una de las más poderosas para alcanzar este objetivo. La información complementaria que aportan los equipos de LC-TOF y LC-QTOF es de gran ayuda en el proceso de elucidación de desconocidos, y de hecho, nos ha permitido detectar y confirmar varios compuestos non target en diferentes tipos de aguas. A pesar del éxito en la elucidación de unos cuantos compuestos, un buen número de intentos resulta infructuoso, debido a las extremas dificultades de este trabajo. Sin duda, se requieren muchas más investigaciones en este apasionante ámbito, en el que la aplicación complementaria de GC-TOF y LC-TOF aparece como una de las mejoras alternativas.

Estudios de exposición de la población a plaguicidas: metabolismo en seres humanos

La preocupación por los efectos nocivos derivados de la utilización de plaguicidas ha ido en aumento en los últimos años como consecuencia del mayor nivel de concienciación sobre los riesgos asociados al uso de este tipo de compuestos. Esta problemática es especialmente importante en zonas agrícolas de cultivo intensivo así como en el sector servicios de tratamientos DDD (desinsectación, desinfección, desratización).

Las matrices biológicas son fundamentales en el aspecto preventivo, ya que su análisis permite llegar a detectar precozmente una exposición excesiva de los trabajadores antes de que se produzcan alteraciones biológicas importantes o de que aparezcan síntomas clínicos; permiten a su vez realizar confirmaciones de diagnóstico y son una excelente alternativa para evaluar la exposición real a plaguicidas.

Para poder utilizar indicadores biológicos de dosis interna, es necesario disponer de métodos de análisis de plaguicidas y de sus metabolitos en matrices biológicas, principalmente en sangre y orina. Sin embargo, la dificultad de los análisis es una de las grandes limitaciones de los estudios relacionados con el control biológico de la exposición a plaguicidas. A pesar de la evolución de las técnicas analíticas los análisis siguen siendo complicados y muy caros y se requieren técnicas analíticas acopladas con espectrometría de masas, en especial LC-MS/MS, además de amplia experiencia y personal suficientemente cualificado.

Es, precisamente, esta problemática analítica la que se viene abordando en los últimos años en nuestro grupo de trabajo, a través de diversos proyectos de investigación. En el proyecto titulado Estudio del potencial de LC-MS/MS para el análisis de plaguicidas en sangre y orina, con especial énfasis en la identificación y elucidación de metabolitos, del Programa sectorial de promoción general del conocimiento, Ministerio Educación y Cultura, se han desarrollado nuevos métodos analíticos basados en LC-MS/MS para la determinación sensible y rápida de diversos plaguicidas y metabolitos en sangre, suero y orina.

Actualmente, se está haciendo uso del potente acoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas con analizador híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo, con el objetivo de investigar la formación de metabolitos de plaguicidas en distintos tipos de muestras de interés ambiental (suelos, aguas) y toxicológico (orina, suero). A pesar de que la técnica LC-QTOF-MS resulta actualmente imprescindible en el ámbito farmacéutico y bioquímico, apenas se ha aplicado en el medioambiental y toxicológico, por lo que pretendemos adentrarnos en áreas en las que existe escasa o nula tradición en cuanto su uso. El proyecto se centra en dos grandes temas: 1) la exposición de las personas a plaguicidas, 2) la problemática ambiental que supone la presencia de plaguicidas en las aguas. En ambos casos, las muestras procedentes de los estudios se investigarán exhaustivamente con un equipo de LC-QTOF-MS, con el fin de identificar los compuestos que se hayan formado fruto del metabolismo, transformación y/o degradación.

Se pretende iniciar una línea de investigación sobre la aplicación de esta técnica en un ámbito de gran interés y actualidad, como es el de los plaguicidas. Se aportará información sobre los metabolitos y productos de transformación más relevantes, lo que permitirá llevar a cabo programas de control de estos compuestos en las aguas, así como la evaluación del grado de exposición de los seres vivos a través de un adecuado control biológico. La metodología de trabajo desarrollada podrá aplicarse, en el futuro, a otros tipos de contaminantes y drogas sobre los que apenas existe información en el ámbito científico en cuanto a su metabolismo/ transformación en seres humanos y en el medio ambiente.

Estas actuaciones se enmarcan dentro del Proyecto de Investigación Aplicación del acoplamiento cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS y LC-QTOF-MS) a la identificación de metabolitos de plaguicidas en muestras de interés ambiental y toxicológico, financiado por el MEC.

Una línea de trabajo relacionada con estos temas se centra en la evaluación de la exposición a compuestos clorados y fosforados mediante su determinación en muestras de tejido adiposo humano, así como en sangre y suero. Para llevar a cabo estos estudios, se ha colaborado con el Laboratorio de Radiología de la Universidad de Granada, con el Gabinete de Seguridad e Higiene en el Trabajo de Castellón y con el Hospital General de Castellón.

Recientemente, se ha iniciado un interesante estudio a largo plazo sobre la presencia de xenoestrógenos en muestras de tejido graso humano y su posible relación con ciertos procesos cancerígenos hormonodependientes, como el cáncer de mama. Este trabajo se desarrolla en colaboración con el Instituto Valenciano de Oncología (IVO) de Valencia.

Estudios sobre acuicultura, con especial énfasis en la toxicidad, bioacumulación y biomagnificación de plaguicidas y compuestos clorados en organismos marinos

Los primeros trabajos en el ámbito de compuestos organoclorados (OC) en organismos marinos se remontan a la década de los años 80 en el Colegio Universitario de Castellón, cuando se llevaron a cabo los primeras determinaciones de OC en distintos tipos de organismos (crustáceos, moluscos y peces) en el marco del Programa de vigilancia de la contaminación del Mediterráneo (MEDPOL). Desde entonces, se ha venido manteniendo una línea continuada de investigación en este ámbito que, lógicamente, ha ido evolucionando y que, cada vez más, se ha basado en trabajos de colaboración con el Instituto de Acuicultura de Torre La Sal, del CSIC.

Las actividades desarrolladas en el Programa MEDPOL, en el que este grupo de investigación participó durante una década, se complementaron con proyectos de investigación, como Nuevas aportaciones a la metodología analítica en la determinación de metales pesados y pesticidas en organismos marinos, sedimentos y aguas residuales, CAICYT, Ministerio de Educación y Ciencia, desarrollado entre 1985 y 1987. Merece destacarse también el proyecto Study of the Toxicity, Bioaccumulation and Persistence of Some Heavy Metals and Pesticides in the Crayfish Procambarus clarkii (Girard) on the Albufera Lake of Valencia. Spain, financiado por la FAO, Mediterranean Action Plan, y llevado a cabo entre 1985 y 1988.

El desarrollo de metodología analítica avanzada ha sido fundamental para mejorar los métodos de análisis de contaminantes orgánicos en este tipo de muestras complejas. Este tema ha sido objeto de diversas colaboraciones con  grupos nacionales y extranjeros, entre los que cabe destacar el National Institute of Public Health and Environment, de Holanda, con el que se desarrolló a mediados de los años 90 una línea de trabajo sobre nuevos métodos automatizados de análisis para compuestos OC y OP en organismos marinos (peces, crustáceos, moluscos, mamíferos). La metodología analítica desarrollada permitió obtener datos de interés sobre niveles de plaguicidas y sus metabolitos en proyectos como Toxicidad, bioconcentración y biodepuración de pesticidas organofosforados en dos especies autóctonas de la Comunidad Valenciana (Aphanius iberus y Artemia sp.). Estudio de la bioacumulación en cadenas tróficas artificiales, financiado por la Generalitat Valenciana, en el que se afrontó la problemática de la bioacumulación de plaguicidas OP en especies acuáticas autóctonas de la Comunidad Valenciana.

Recientemente, se ha realizado un proyecto sobre Problemática de los contaminantes organoclorados en piscicultura. Bioacumulación de los plaguicidas y bifenilos policlorados a través de los alimentos de origen marino y su posible incidencia en el hombre, financiado por la Generalitat Valenciana. Se trata de una línea de investigación que se viene desarrollando desde hace varios años en colaboración con el Instituto de Acuicultura de Torre la Sal (IATS), del CSIC. El objetivo principal es caracterizar los piensos, harinas y aceites de pescado usados para la alimentación de peces en acuicultura en lo referente a contenidos de contaminantes persistentes organoclorados. A partir de esta información, se pretende estudiar el grado de acumulación de estos contaminantes en animales que hayan sido alimentados con estos piensos y evaluar la posible incidencia y los riesgos para la salud de la personas, como último eslabón de la cadena trófica.

Esta línea de trabajo forma parte de las investigaciones sobre bioacumulación de contaminantes en organismos marinos que se llevaban realizando en nuestro grupo desde hace casi diez años. En este contexto, se presentó en 2002 una expresión de interés (EOI) por parte del Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) sobre un proyecto integrado en el que figura nuestro grupo de investigación Genomics and proteomics to improve the safety and quality of aquaculture products. En el ámbito de la contaminación marina, nuestro grupo de investigación está involucrado igualmente en otra EOI sobre el proyecto integrado Knowledge based policy building strategies for marine contaminant reduction (Mediterranean), coordinado por el centro francés IFREMER, con el cual se mantienen contactos regularmente a través de su coordinador científico, Axel Romana.

Con la concesión, a finales de 2003, del proyecto Depuración del ácido domoico en dos bivalvos de interés comercial de la Comunidad Valenciana: chirla (Chamelea gallina) y tellina (Donx trunculus). Estudios de la efectividad de la n-acetil-cisteína como agente detoxificador, se abre una nueva línea de investigación orientada al estudio de toxinas naturales en el medio marino, y al ensayo de agentes detoxificadores que permitan una rápida depuración de las toxinas por parte de los organismos marinos de interés comercial.

Con este primer estudio, realizado en colaboración con investigadores del IAST, se pretende conocer mejor y aportar soluciones al problema de la contaminación por ácido domoico (amnesic shellfish poisoning, ASP), una neurotoxina que periódicamente afecta a las poblaciones de moluscos, como consecuencia de la multiplicación masiva esporádica de algunas especies de microalgas diatomeas capaces de sintetizar esta neurotoxina natural.

La aparición de mareas rojas y la contaminación de moluscos cultivados en las bahías del Delta del Ebro provocan periódicamente la pérdida de campañas enteras en la comercialización de estos moluscos bivalvos. El último episodio de este tipo ocurrió en los veranos de 2002 y 2003 en la bahía dels Alfacs del Delta del Ebro, donde se perdieron las campañas veraniegas del mejillón. Como consecuencia de este evento, los granjeros de la zona se pusieron en contacto con el IATS (CSIC) y con el Grupo de Investigación de Ecotoxicología Marina del IUPA (UJI).

Con la concesión, a finales de 2003, del proyecto “Depuración del ácido domoico en dos bivalbos de interés comercial de la Comunidad Valenciana: chirla (Chamelea gallina) y tellina (Donx trunculus)” concedido en el marco del Plan de Fomento de Investigación UJI-BANCAIXA, se abrió un nuevo campo de investigación que incluye dos líneas bien diferenciadas.

Por una parte, es necesario el desarrollo de metodología analítica capaz de determinar las diferentes toxinas marinas organismos marinos. Actualmente, esta línea de trabajo se centra en el desarrollo de métodos multirresiduales basados en Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas en Tandem (HPLC-MS/MS). La metodología a desarrollar debe identificar de forma inequívoca las diferentes moléculas a bajos niveles de concentración. Estas incluyen toxinas de las familias de toxinas ASP (Amnesic Shellfish Poisoning), PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) y DSP (Diarrheic Shellfish Poisoning).

La segunda línea de investigación consiste en el estudio de la bioacumulación y depuración de estas toxinas en bivalvos. Para ello, es fundamental la aplicación de una metodología adecuada, descrita anteriormente, que permita la determinación de bajos niveles de concentración y la determinación de las cinéticas de la forma más exacta posible.

Con el objeto de paliar los efectos de las mareas rojas en las granjas de bivalvos, los trabajos sobre ecotoxicocinética derivaron en la búsqueda de fármacos capaces de acelerar la eliminación y destoxificación de xenobióticos, en especial toxinas marinas, en colaboración con el IATS (CSIC).

En concreto, se ha ensayado la efectividad de la N-acetilcisteína (NAC) como agente destoxificador. Se pretende acelerar la depuración de plaguicidas y de ácido domoico en los moluscos bivalvos mediante la adición al medio de NAC. El objetivo último de esta parte del proyecto es determinar la capacidad de la NAC para la eliminación de plaguicidas y toxinas naturales en menos de 48 h, que es el tiempo mínimo obligatorio de depuración antes de la comercialización de los bivalvos. Los estudios descritos han desembocado en una patente española consistente en un método para la destoxificación de bivalvos.

Dentro de esta misma línea, en 2007 comenzó la ejecución del Proyecto financiado por el MEC, en el marco del programa de transferencia de resultados de investigación (PETRI) “Depuración de contaminantes en moluscos bivalvos mediante el tratamiento con N-Acetilcisteina”.

Los planes sobre futuras investigaciones incluyen la ampliación de la lista de toxinas a investigar, apoyándonos en metodologías analíticas de última generación. Además, se estudiará la posibilidad de cultivar especies de algas  capaces de la producción de toxinas, así como su aplicación en estudios de ecotoxicocinética en organismos marinos.